Εργαστήριο Πειραματικού Σχεδιασμού στη Συνθετική Βιολογία

Μαθησιακά Αποτελέσματα

Μετά την επιτυχή ολοκλήρωση του μαθήματος, οι φοιτητές/-τριες αναμένεται να:

• Κατανοούν τις θεωρητικές αρχές που διέπουν βασικές εργαστηριακές τεχνικές της συνθετικής βιολογίας,
• Εξηγούν τα κύρια στάδια κατασκευής ανασυνδυασμένων πλασμιδίων και μοριακής κλωνοποίησης,
• Περιγράφουν τις αρχές καλλιέργειας ευκαρυωτικών κυττάρων και παροδικής γονιδιακής έκφρασης,
• Κατανοούν τη βάση της φθορίζουσας σήμανσης, της μικροσκοπίας και της ανάλυσης κυττάρων μέσω εικόνας,
• Εξηγούν τις αρχές και τις εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής για ανάλυση μεμονωμένων κυττάρων,
• Αναγνωρίζουν τον ρόλο των μαρτύρων (controls), της αξιολόγησης ποιότητας και της ερμηνείας δεδομένων στις πειραματικές διαδικασίες,
• Κατανοούν τον τρόπο ενσωμάτωσης μοριακών, κυτταρικών, απεικονιστικών και κυτταρομετρικών μεθόδων στην έρευνα της συνθετικής βιολογίας.

Επιπλέον, οι φοιτητές/-τριες θα έχουν αποκτήσει τις ακόλουθες δεξιότητες:

• Εφαρμόζουν βασικές εργαστηριακές τεχνικές μοριακής βιολογίας,
• Εκτελούν βασικές διαδικασίες καλλιέργειας ευκαρυωτικών κυττάρων
• Προετοιμάζουν και αναλύουν βιολογικά δείγματα με χρήση τεχνικών απεικόνισης βασισμένων σε φθορισμό
• Πραγματοποιούν προετοιμασία δειγμάτων και λήψη δεδομένων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής
• Εφαρμόζουν τη ροή εργασίας Design–Build–Test–Learn (DBTL) σε πρακτικά εργαστηριακά πειράματα, από την κατασκευή πλασμιδίων έως την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης σε ευκαρυωτικά κύτταρα

Τέλος, οι φοιτητές/-τριες θα επιδεικνύουν τις εξής ικανότητες:

• Αναλύουν, να αξιολογούν και να ερμηνεύουν πειραματικά δεδομένα που προκύπτουν από μοριακά, κυτταρικά και απεικονιστικά πειράματα,
• Επικοινωνούν αποτελεσματικά τις πειραματικές διαδικασίες και τα αποτελέσματα.

Περιεχόμενο Μαθήματος

Αυτό το μάθημα παρέχει ολοκληρωμένη πρακτική εκπαίδευση στις θεμελιώδεις εργαστηριακές τεχνικές που απαιτούνται στη συνθετική βιολογία. Δίνεται έμφαση στην ανάπτυξη πρακτικών πειραματικών δεξιοτήτων και στην ερμηνεία πειραματικών δεδομένων. Μέσα από μια σειρά καθοδηγούμενων εργαστηριακών ασκήσεων, οι φοιτητές/-τριες αποκτούν πρακτική εμπειρία στον μοριακό χειρισμό, στις τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας, στις τεχνολογίες απεικόνισης και στις μεθόδους κυτταρομετρίας ροής.

Το πρόγραμμα των εργαστηριακών ασκήσεων περιλαμβάνει τις ακόλουθες ενότητες:

Ενότητα 1 – Κλωνοποίηση και Κατασκευή Πλασμιδίων

Το μάθημα ξεκινά με εκπαίδευση στις τεχνικές μοριακής κλωνοποίησης. Οι φοιτητές/φοιτήτριες σχεδιάζουν και εκτελούν αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την ενίσχυση μιας πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινης πυρηνικής πρωτεΐνης, πέψη με ένζυμα περιορισμού, καθαρισμό τμημάτων DNA και κλωνοποίηση σε ευκαρυωτικούς πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης, σχεδιασμένους για την παραγωγή πρωτεϊνών συντηγμένων με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Περιλαμβάνονται επίσης αντιδράσεις σύνδεσης (ligation), μετασχηματισμός βακτηρίων, καθώς και στρατηγικές επιλογής και διαλογής για την αναγνώριση ανασυνδυασμένων κλώνων.

• Άσκηση 1: Εισαγωγή στη Μοριακή Κλωνοποίηση και τον Πειραματικό Σχεδιασμό (Κανόνες ασφαλείας και εργαστηριακές διαδικασίες, επισκόπηση στρατηγικής κλωνοποίησης, σχεδιασμός εκκινητών, πλασμιδιακοί φορείς και θέσεις κλωνοποίησης).
• Άσκηση 2: Πολλαπλασιασμός του cDNA-στόχου μέσω PCR.
• Άσκηση 3: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή και πέψη με ένζυμα περιορισμού
• Άσκηση 4: Καθαρισμός DNA και Αντίδραση σύνδεσης (Ligation)
• Άσκηση 5: Βακτηριακός μετασχηματισμός
• Άσκηση 6: Διαλογή ανασυνδυασμένων κλώνων.

Ενότητα 2- Καλλιέργεια και Επιμόλυνση Ευκαρυωτικών Κυττάρων

Το δεύτερο μέρος του μαθήματος επικεντρώνεται στις τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας. Οι φοιτητές/-τριες εισάγονται στις πρότυπες πρακτικές για τη συντήρηση και τον χειρισμό καλλιέργειας κυττάρων, στις αρχές βιοασφάλειας, στις τεχνικές υπό ασηπτικές συνθήκες και στη διαχείριση εργαστηριακών αποβλήτων. Αυτή η ενότητα περιλαμβάνει επίσης μεθόδους παροδικής επιμόλυνσης (transient transfection).

• Άσκηση 7: Εισαγωγή στις κυτταροκαλλιέργειες (διαδικασίες βιοασφάλειας, ασηπτικές συνθήκες, προετοιμασία θρεπτικών μέσων και χειρισμός κυττάρων)
• Άσκηση 8: Συντήρηση κυττάρων και Ποιοτικός έλεγχος (Ανακαλλιέργεια κυττάρων, παρακολούθηση κυτταρικής μορφολογίας, καταμέτρηση κυττάρων)
• Άσκηση 9: Παροδική επιμόλυνση (Επιμόλυνση κυττάρων HeLa με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο GFP, βελτιστοποίηση των συνθηκών επιμόλυνσης).

Ενότητα 3- Φθορίζουσα και Συνεστιακή Μικροσκοπία

Το μάθημα παρέχει επιπλέον πρακτική εκπαίδευση στη μικροσκοπία φωτός και φθορισμού. Οι φοιτητές/φοιτήτριες εξοικειώνονται με τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων, με τη χρήση φθοριζόντων ανιχνευτών για τη σήμανση κυτταρικών δομών, με τη λειτουργία μικροσκοπίων φθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας, καθώς και με τη χρήση λογισμικού ανάλυσης εικόνας για ποσοτική επεξεργασία και αξιολόγηση δεδομένων.

• Άσκηση 10: Χρώση ανοσοφθορισμού (Προετοιμασία δείγματος: Μονιμοποίηση και και διαπερατοποίηση διαμολυσμένων κυττάρων, επώαση των κυττάρων με ειδικούς φθορίζοντες ανιχνευτές για την απεικόνιση υποκυτταρικών οργανιδίων, π.χ. DAPI για χρώση του πυρήνα· έμμεση ανοσοφθορίζουσα ανάλυση με χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι πυρηνικών λαμινών και δευτερογενών αντισωμάτων συζευγμένων με φθοροχρώματα).
• Άσκηση 11: Συνεστιακή Μικροσκοπία Σάρωσης με Λέιζερ,CLSM : Εισαγωγή στη συνεστιακή μικροσκοπία, λήψη εικόνων μεμονωμένης τομής και πολλαπλών καναλιών, ποσοτική ανάλυση εικόνας

Ενότητα 4- Κυτταρομετρία ροής

Τέλος, το μάθημα περιλαμβάνει εκπαίδευση στην κυτταρομετρία ροής. Οι φοιτητές/φοιτήτριες αποκτούν εμπειρία στην προετοιμασία δειγμάτων, στη ρύθμιση του οργάνου και στη συλλογή δεδομένων. Εξοικειώνονται με την απόκτηση και ερμηνεία κυτταρομετρικών δεδομένων και εφαρμόζουν στρατηγικές για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών.

Άσκηση 12 – Προετοιμασία δειγμάτων κυτταρομετρίας, λήψη και ανάλυση δεδομένων, προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης, εφαρμογή στρατηγικών επιλογής πληθυσμών για την αναγνώριση των GFP-θετικών κυττάρων.

Ενότητα 5- Παρουσίαση Αποτελεσμάτων

Στο τέλος του εργαστηριακού μαθήματος, οι φοιτητές/φοιτήτριες παρουσιάζουν τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την πειραματική τους εργασία. Παράλληλα, προχωρούν σε ανάλυση και ερμηνεία των δεδομένων τους, συζητούν πιθανές αποκλίσεις ή ασυνέπειες στα πειραματικά αποτελέσματα και τα συγκρίνουν με τις αναμενόμενες παρατηρήσεις.

Συνιστώμενη Βιβλιογραφία

• Brown, T. A. (2020). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (8th ed.). Wiley-Blackwell.
• Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (7th ed.). Wiley-Blackwell.
• Murphy, D. B., & Davidson, M. W. (2012). Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (2nd ed.). Wiley-Blackwell.
• Pawley, J. B. (Ed.). (2006). Handbook of Biological Confocal Microscopy (3rd ed.). Springer.
• Givan, A. L. (2013). Flow Cytometry: First Principles (2nd ed.). Wiley-Blackwell.